第三课　蛋白质组学研究工具

一、Liquichip液相蛋白芯片系统——新型的蛋白质研究平台

　　随着人类基因组测序接近尾声，我们迎来了功能基因组时代，为了揭示生命活动的规律，蛋白质研究是必然的发展方向。
　　在人体中存在着十万种以上的蛋白质，他们在机体中承担着不同的任务。在面对动态的多因素的生命活动时，识别和检测蛋白质以及认识其生理功能是非常艰巨的和繁重的工作。
　　为了使蛋白质研究顺利开展并取得突破，人们在技术体系的改进方面做出了不懈的努力，最新开发出的liquichip 液相蛋白芯片系统就是一种新型的蛋白质研究平台。

　　液相芯片体系由许多不同的小球体为主要基质构成，每种小球体上固定有不同的探针分子，将这些小球体悬浮于一个液相体系中，就构成了一个液相蛋白质芯片系统，利用这个系统，我们可以对同一个样品中的多个不同的分子同时进行检测，这种检测技术我们称之为xMAP(flexible Multi-Analyte Profiling) 技术。
　　在液相系统中，为了区分不同的探针，每一种用于标记探针的球形基质都带有一个独特的色彩编号。在球形基质的制造过程当中，掺入了两种不同的红色分类荧光，根据这两种红色分类荧光的比例不同，可以把球形基质分为100种。利用这100种球形基质，可以标记上100种不同的探针分子，同时对一个样本中的100种不同的目的分子进行检测。
　　为了便于探针分子的固定，在球形基质的表面进行了一系列的修饰，可适合各种蛋白，肽，核酸等生物分子的固定。

检测反应的原理

　　球形基质,探针分子,被检测物,报告分子是液相蛋白芯片的4个主要构成部分。
　　反应主要包括3个步骤
　　1） 探针分子的固定，
　　2） 将这种标记好探针的球形基质与样品反应。探针可以与相应的目的分子特异性的结合，带有绿色报告荧光的报告分子也与目的分子特异性的结合，对反应进行定量。
　　3） 反应结果的检测

检测的原理图

　　检测的原理是使单个的球形基质通过检测通道，并使用双色激光同时对球形基质上的红色分类荧光和报告分子上的绿色报告荧光进行检测。红色激光激发的是球形基质上的红色分类荧光，根据球形基质的不同色彩编号，可以将球形基质分类，从而将各个不同的分析反应区分开来。绿色激光激发的是绿色报告荧光分子，目的是确定球形基质上结合的报告荧光分子的数量，从而确定球形基质上结合的目的分子的数量。因此，通过红绿双色激光的同时检测，可以确定被结合的检测物的种类和数量。
　　液相芯片的特点：
　　液相芯片的独特设计使得它拥有常规的蛋白质检测方法所不具备的特点：
　　 通量大
—— 可对同一样本中的多种不同目的分子同时进行分析
—— 在35-60分钟内可对96个不同样本进行检测
　　 灵活性好，可适用于各种蛋白质分析，可以接受实验室已有的实验方案，使用者可以自行设计分析方案，也可使用成套试剂盒。
　　 液相环境更有利于保持蛋白质的天然构象，也更有利于探针和被检测物的反应
　　 灵敏度高，信噪比好，只需要微量的样品即可进行检测
　　 操作简便，不需洗涤，耗时短

　　同一样本中的多个不同的分子进行同步检测的原理示意图
　　在不同的球形基质上分别固定不同的探针，混合后加入到一个液相检测体系中，不同的探针可以和不同的目的分子进行结合，反映结束后通过激光检测球形基质的色彩编号可以对不同的检测反应加以区分
　
　　Highly sensitive assays

　　Liquichip和ELISA灵敏度的比较
　　分别用ELISA和liquichip 对硫氧还蛋白进行定量测定得到的标准曲线
　　I: 使用liquichip测定得到的标准曲线
　　II、III：使用ELISA测定得到的标准曲线
　　可以看出liquichip的灵敏度更高，在更低的蛋白质浓度下，曲线即呈现线性趋势。

　　液相蛋白芯片的应用
　　Liquichip液相芯片系统是一个高度灵活的多元分析平台，可以适用于蛋白质组学研究，临床研究和药物研究中的各种蛋白质分析。
　　包括：
　　 免疫分析
　　 酶分析
　　 受体-配基分析
　　 蛋白质 - 蛋白质相互作用分析
　　 蛋白质 - 核酸相互作用分析

　　由于液相芯片具有，灵活性好，操作简单，通量大等特点，目前已经被用在细胞因子的检测，激酶的检测，抗原决定簇的筛选，疾病的检测，以及与各种抗原抗体反应相关的检测当中。

　　美国圣祖德儿童研究医院的 Dr.Richard 等人, 使用液相芯片对100ul样本中的15种不同的细胞因子同时进行了精确的定量测定。结果说明在T辅助细胞1型与2型中，某些细胞因子的表达量有显著差异。在测定过程中，Dr.Richard将15种不同的细胞因子的抗体分别标记在15种不同的球形基质上，混合后加入到一个反应体系中，对同一样本中的15种细胞因子进行测定。同时用ELISA的方法，分别对15种细胞因子进行检测。将两组结果进行对比后发现，趋势基本上一致，但是液相芯片可同时对多个分子进行检测，同时灵敏度和可靠性更好，操作更为简单。这样只需要使用微量的样品，在较短的时间内，就可以得到所需的数据。

　　相关产品 [货号]:
　　细胞因子检测试剂盒
　　LiquiChip Mouse 10-Cytokine Kit (100 ) [922028]
　　LiquiChip Human 10-Cytokine Kit (100 ) [922008]
　　激酶检测试剂盒
　　LiquiChip Ser/Thr Kinase Kit (100) [922080]
　　检测仪器
　　LiquiChip Workstation [920180]

二、研究蛋白质相互作用的技术平台——酵母双杂交系统的发展和应用

　　随着对多种重要生物的大规模基因组测序工作的完成，基因工程领域又迎来了一个新的时代---功能基因组时代。它的任务就是对基因组中包含的全部基因的功能加以认识。生物体系的运作与蛋白质之间的互作密不可分，例如：DNA合成、基因转录激活、蛋白质翻译、修饰和定位以及信息传导等重要的生物过程均涉及到蛋白质复合体的作用。能够发现和验证在生物体中相互作用的蛋白质与核酸、蛋白质与蛋白质是认识它们生物学功能的第一步。
　　酵母双杂交技术作为发现和研究在活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平台，在近几年来得到了广泛运用。酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测得到，它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。大量的研究文献表明，酵母双杂交技术既可以用来研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的互作，也可以用来研究高等植物基因组编码的蛋白质之间的互作。因此，它在许多的研究领域中有着广泛的应用。本文就酵母双杂交的技术平台和应用加以介绍。
　　酵母双杂交系统的建立是基于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。反式转录激活因子，例如酵母转录因子GAL4在结构上是组件式的（modular），往往由两个或两个以上结构上可以分开，功能上相互独立的结构域（domain）构成，其中有DNA结合功能域(DNA binding domain,DNA-BD)和转录激活结构域（activation domain，DNA-AD）。这两个结合域将它们分开时仍分别具有功能，但不能激活转录，只有当被分开的两者通过适当的途径在空间上较为接近时，才能重新呈现完整的GAL4转录因子活性，并可激活上游激活序列（upstream activating sequence, UAS）的下游启动子，使启动子下游基因得到转录。
　　根据这个特性，将编码DNA-BD的基因与已知蛋白质Bait protein的基因构建在同一个表达载体上，在酵母中表达两者的融合蛋白BD-Bait protein。将编码AD的基因和cDNA文库的基因构建在AD-LIBRARY表达载体上。同时将上述两种载体转化改造后的酵母，这种改造后的酵母细胞的基因组中既不能产生GAL4，又不能合成LEU、TRP、HIS、ADE，因此，酵母在缺乏这些营养的培养基上无法正常生长。当上述两种载体所表达的融合蛋白能够相互作用时，功能重建的反式作用因子能够激活酵母基因组中的报告基因HIS、ADE、LACZ、MEL1，从而通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落。将阳性反应的酵母菌株中的AD-LIBRARY载体提取分离出来，从而对载体中插入的文库基因进行测序和分析工作。在酵母双杂交的基础上，又发展出了
酵母单杂交、酵母三杂交和酵母的反向杂交技术。它们被分别用于核酸和文库蛋白之间的研究、三种不同蛋白之间的互作研究和两种蛋白相互作用的结构和位点。
　　基于酵母双杂交技术平台的特点，它已经被应用在许多研究工作当中。
　　1、利用酵母双杂交发现新的蛋白质和蛋白质的新功能
　　酵母双杂交技术已经成为发现新基因的主要途径。当我们将已知基因作为诱饵，在选定的cDNA文库中筛选与诱饵蛋白相互作用的蛋白，从筛选到的阳性酵母菌株中可以分离得到AD-LIBRARY载体，并从载体中进一步克隆得到随机插入的cDNA片段，并对该片段的编码序列在GENEBANK中进行比较，研究与已知基因在生物学功能上的联系。另外，也可作为研究已知基因的新功能或多个筛选到的已知基因之间功能相关的主要方法。例如：Engelender等人以神经末端蛋白alpha-synuclein 蛋白为诱饵蛋白，利用酵母双杂交CLONTECH MATCHMARKER SYSTEM 3为操作平台，从成人脑cDNA文库中发现了与alpha-synuclein相互作用的新蛋白Synphilin-1，并证明了Synphilin-1与alpha-synuclein 之间的相互作用与帕金森病的发病有密切相关。为了研究两个蛋白之间的相互作用的结合位点，找到影响或抑制两个蛋白相互作用的因素，Michael等人又利用酵母双杂交技术和基因修饰证明了alpha-synuclein的1-65个氨基酸残基和Synphilin-1的349-555个氨基酸残基之间是相互作用的位点。研究它们之间的相互作用位点有利于基因治疗药物的开发。

　　2、利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用
　　利用酶联免疫（ELISA）、免疫共沉淀（CO-IP）技术都是利用抗原和抗体间的免疫反应，可以研究抗原和抗体之间的相互作用，但是，它们都是基于体外非细胞的环境中研究蛋白质与蛋白质的相互作用。而在细胞体内的抗原和抗体的聚积反应则可以通过酵母双杂交进行检测。例如：来源于矮牵牛的黄烷酮醇还原酶DFR与其抗体scFv的反应中，抗体的单链的三个可变区A4、G4、H3与抗原之间作用有强弱的差异。Geert等利用酵母双杂交技术，将DFR作为诱饵蛋白，编码抗体的三个可变区的基因分别被克隆在AD-LIBRARY载体上，将BD-BAIT载体和每种AD-LIBRARY载体分别转化改造后的酵母菌株中，并检测报告基因在克隆的菌落中的表达活性，从而在活细胞的水平上检测抗原和抗体的免疫反应。
　　3、利用酵母双杂交筛选药物的作用位点以及药 物对蛋白质之间相互作用的影响
酵母双杂交的报告基因能否表达在于诱饵蛋白与靶蛋白之间的相互作用。对于能够引发疾病反应的蛋白互作可以采取药物干扰的方法，阻止它们的相互作用以达到治疗疾病的目的。例如：Dengue病毒能引起黄热病、肝炎等疾病，研究发现它的病毒RNA复制与依赖于RNA的RNA聚合酶（NS5）与拓扑异构酶NS3，以及细胞核转运受体BETA-importin的相互作用有关。研究人员通过酵母双杂交技术找到了这些蛋白之间相互作用的氨基酸序列。如果能找到相应的基因药物阻断这些蛋白之间的相互作用，就可以阻止RNA病毒的复制，从而达到治疗这种疾病的目的。

　　4、利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图（Genome Protein Linkage Map）
　　众多的蛋白质之间在许多重要的生命活动中都是彼此协调和控制的。基因组中的编码蛋白质的基因之间存在着功能上的联系。通过基因组的测序和序列分析发现了很多新的基因和EST序列，HUA等人利用酵母双杂交技术，将所有已知基因和EST序列为诱饵，在表达文库中筛选与诱饵相互作用的蛋白，从而找到基因之间的联系，建立基因组蛋白连锁图。对于认识一些重要的生命活动：如信号传导、代谢途径等有重要意义。

参考文献
Analysis of synphilin-1 and synuclein interactions by yeast two hybrid b-galactosidase liquid assay
Michael Neystata, et.al Neuroscience Letters 325 (2002) 119–123
Synphilin-1 associates with alpha-synuclein and promotes the formation of cytosolic inclusions
Engelender, S et.al. Nat. Genet., 22 (1999) 110–114.
Analysis of the interaction between single-chain variable fragments and their antigen in a reducing intracellular environment using the two-hybrid system
Geert De Jaeger,et.al. FEBS Letters 467 (2000) 316^320
Characterisation of inter- and intra-molecular interactions of the dengue virus RNA dependent RNA polymerase as potential drug targets
Subhash G.et.al. Farmaco 56 (2001) 33–36
Construction of a modular yeast two-hybrid cDNA library from human EST clones for the human genome protein linkage map
Shao-bing Hua, et.al. Gene 215 (1998) 143–152
Developing Yeast Hybrid System
ZHANG,et.al. Chinese Bulletin of Life Sciences 12(2000)34-36
Yeast two-hybrid system and its applications
ZHANG xiao-guang et.al Chinese Bulletin of Life Sciences 13(2001)228-231

三、蛋白活性研究的新工具——乙酰化系列抗体

　　人体的各种生理反应都是由蛋白参与和调节的，而这些蛋白的表达和活性同时也受多水平，多方面的调节。这种调节既有转录水平的，也有翻译水平。既有转录后的修饰，也可以是蛋白翻译后的修饰调节。对这些蛋白的调节也有多种的形式，包括磷酸化——去磷酸化，乙酰化——去乙酰化，羧基化，甲基化，糖基化等等。这种多水平，多方面的调节构成了人体内庞大而复杂的调节体系，精确地调节了人体内的各种生理、生化反应。

　　蛋白的乙酰化和去乙酰化是蛋白活性调节的一种重要的形式，通过乙酰化或去乙酰化，改变了染色质结构或是转录因子的活性，可以调节基因转录的活性。而乙酰化的辅酶A在许多反应中都扮演着重要的角色。对这些乙酰化蛋白展开研究已经成为许多蛋白活性调节研究中的重点。目前乙酰化研究已经成为基因表达、蛋白组学、酶动力学研究中的一个重要方面。
　　组蛋白是染色质中核小体的主要结构元件。核小体主要由四种组蛋白（H2A,H2B,H3和H4）构成。这四种组蛋白和缠绕在组蛋白的DNA共同组成了染色质。在研究中发现基因的表达并不仅仅由DNA决定，组蛋白的修饰（乙酰化、磷酸化和甲基化）所引起的结构变化同样能影响基因的开关，并且这种变化同样也调控着基因的转录，影响着基因的表达。组蛋白的乙酰化和去乙酰化能打开或关闭某些基因，增强或抑制某些基因的表达。例如H2B蛋白能在Lysines5,12,15和20乙酰化，H3蛋白能在Lysines9,14,18和23乙酰化。　　Lysines9的乙酰化在组蛋白的堆积和染色质的装配中起了关键的作用。而这种作用最终影响了基因的表达。在多种疾病中，都存在组蛋白编码错误的迹象。因此，有人将组蛋白编码称之为“第二套遗传密码”。组蛋白的乙酰化修饰对于研究基因的表达调控至关重要。目前尚缺乏能准确识别乙酰化和非乙酰化蛋白的抗体，为此CST公司推出了可用于蛋白功能检测的乙酰化组蛋白系列抗体,圆满的解决这个问题。
　　因为乙酰化与蛋白的活性相关，因此通过乙酰化的系列抗体特异性地识别靶蛋白的乙酰化形式，可以反映出靶蛋白质的活性水平，达到研究蛋白功能和调节的目的。而其他的抗体仅能反映出该蛋白质的表达量或表达水平，不能反映出蛋白的活性状态。
　　乙酰化系列抗

　　优化的试剂
　　随芯片试剂盒提供的蛋白抽提/标记缓冲液，是专门为抗体芯片而设计的，非常温和的去垢剂在能高效抽提膜结合蛋白（相比SDS煮沸法能抽提95%以上的蛋白）的同时能保持蛋白的天然活性（非变性条件），这样能够保证抽提的蛋白的溶解性和代表性，保证以后的实验结果的真实性，和原始材料的一致性。

　　Internally Normalized Ratio
　　内源标准化处理可以得到一个内源标准化信噪比（INR），内源标准化处理是指对两个样品（A、B）中分别用两种荧光标记分子（Cy3和Cy5）标记，并交叉与芯片杂交（见图，A-Cy5和B-Cy3一组,A-Cy3和B-Cy5一组分别和芯片杂交），可以作为消除抗原—抗体结合效率差异的对照，也可以消除潜在的不同荧光分子的标记效率差异。假如Cy5标记效率高于Cy3，单纯一个实验的结果就会有偏差（Cy5标记的样品信号偏高），用这种双向交叉反应就可以消除这种偏差。两芯片杂交结果分别得到两组Ratio值，通过免费下载的工具就可以自动算出每个抗体抗原的INR值，这就代表在两个样品间某个蛋白的相对丰度。这种内源标准化处理可以大大减小样品分析的偏差。
　　抗体芯片检测的结果不是蛋白的绝对含量而是378个目的蛋白在两个样品之间的相对丰度。值得注意的是由于抗体抗原结合的差异、标记差异等原因，根据芯片结果信号的强弱判断同一样品中两种不同蛋白的多少是不恰当的。