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第三章 芯片操作流程
待检测样品制备
杂交
图象的采集和分析
生物芯片（DNA微阵列）荧光扫描仪中的激光共聚焦扫描技术
生物样品往往是非常复杂的生物分子混合体，除少数特殊样品外，一般不能直接与芯片反应，必须将样品进行生物处理。从血液或活组织中获取的DNA/mRNA样品在标记成为探针以前必须扩增以提高阅读灵敏度，但这一过程操作起来却有一定的难度。比如在一个癌细胞中有成千上万个正常基因的干扰，杂合癌基因的检测和对它的高效、特异地扩增就不是一件容易的事。因为在一般溶液中PCR扩增时，靶片段太少且不易被凝胶分离，故存在其它不同的DNA片段与其竞争引物的情况。美国Mosaic Technology公司发展了一种固相PCR系统。此系统包含两套引物，每套都可以从靶基因两头延伸。当引物和DNA样品及PCR试剂相混时，如果样品包含靶序列，DNA就从引物两头开始合成，并在引物之间形成双链DNA环或"桥"。由于上述反应在固相中产生，因而避免了引物竞争现象，并可减少残留物污染和重复引发。
根据样品来源、基因含量、检测方法和分析目的不同，采用的基因分离、扩增及标记方法各异。为了获得基因的杂交信号必须对目的基因进行标记。标记方法有荧光标记法、生物素标记法、同位素标记法等。目前采用的最普遍的荧光标记方法与传统方法如体外转录、PCR、逆转录等原理上并无多大差异，只是采用的荧光素种类更多，这可以满足不同来源样品的平行分析。
样品制备的常用试剂：对于检测表达的芯片，样品制备通常涉及（m）RNA的纯化，cDNA的合成，体外转录或者PCR，标记等步骤。而对于SNP或者突变检测，则往往涉及Genomic
DNA纯化和PCR、标记等步骤。
1. RNA纯化：
从样品中分离纯化高质量的RNA是非常重要的第一步。由于RNA样品中的DNA碎片会影响后继的PCR反应，所以要彻底除去样品中的DNA。通常用mRNA纯化的方法可以除去DNA片断，或者用RNase-Free的DNase处理RNA样品。在这里我们介绍一些常用的RNA纯化试剂盒，特别是由Affymetrix公司推荐的QIAGEN
RNA纯化系列。
* RNeasy Protect Kit：
一旦生物样品被收集分离，它的RNA会立刻变得非常不稳定，极易被降解。由于特异及非特异的RNA降解，或者由于应激反应产生新的RNA都会引起RNA状态的改变。对于生物芯片、基因表达矩阵分析（Array
Analysis）、定量RT-PCR等实验来说，采样后立即稳定样品里的RNA以保存当时RNA的表达状态，是精确/定量研究基因表达分析的重要前提。为了达到这个目的，往往需要将液氮或者干冰带到采样现场，采样后立即抽提RNA或者运回实验室保存。对于实验者来说非常不方便。
著名的QIAGEN公司最近新推出一种RNA抽提试剂：RNeasy Protect Kit，提供一整套RNA保护和分离试剂，从样品的制备到RNA的抽提，只需一个试剂盒即可解决所有问题。保证样品的表达信息不受破坏，确保得到可信的基因表达分析结果。
试剂盒里提供一种RNAlater RNA Stabilization Reagent，只要在采样后立即将新鲜样品浸入这种液体试剂，RNA保护剂可以迅速渗透到组织或其他生物样本中，稳定并保护RNA完整而不被降解，确保下游分析得到的数据真实反应样品的表达信息。保存在RNAlater中的样品RNA可以在37度下稳定保存1天，或者在18-25度保存7天，2-8度稳定4周，或者在-20度永久保存。这种技术为在不同温度下采样，运输和保存样品提供了极大的方便，特别适用于各种动物组织、培养细胞、细菌、白细胞，但必须说明的是它不适用于全血或体液中RNA的保存。
RNAlater的用法非常简单，只要在采样后立即将样品完全浸入适量（10ul/1mg组织）的RNAlater中即可。取样的动作要尽量快速利索，组织样品的大小以不超过0.5公分厚为宜，对于一些小的组织如小鼠的脾、肾等器官则可以整个取出浸入溶液中，较大的则应切开为厚度小于0.5公分的小块，以确保RNAlater
能迅速扩散渗透入组织块中的所有细胞中。采样的容器应该足够大以容纳10倍于组织重量的溶液，避免组织块挤在一起，同时建议将溶液加满容器以避免在运输过程中组织块露出液面。注意本试剂只适用于新鲜样品，对于冷藏和包埋的样品直接抽提RNA即可。另外对于RNA已经降解的样品，RNAlater只能保护剩下的样品RNA，不能修复已破坏的RNA。
保存后的样品可以直接用于RNA或者mRNA的抽提。RNAlater不会影响组织块的结构，可以在室温下切出适量的组织块用于称量和抽提RNA，剩下的部分可用于继续保存样品。-20度冻存的样品可以取出在室温下进行称量等操作而无需干冰。在-20度冻存的样品反复冻融20次RNA依然保持完好无损。RNAlater处理的样品比新鲜组织稍微硬一点，但不会影响匀浆过程。取出适量的样品即可开始加RLT缓冲液进行匀浆化。
和传统的RNeasy Kit一样，RNeasy Protect Kits采用QIAGEN著名的硅胶膜纯化柱技术，迅速特异地吸附样品裂解液中的RNA，无需酚氯仿抽提，不用乙醇沉淀或LiCl沉淀，也不用CsCl超离，只要洗脱即可得到纯的RNA。通常情况下RNeasy的纯化技术足以除去绝大部分的DNA，而无需额外进行DNaes处理，但是对于一些对痕量DNA非常敏感的实验，用RNase-Free
DNase Set（QIAGEN cat.no. 79254）可以直接在纯化柱上消化DNA残留，在随后的洗涤步骤中除去DNase，最后洗脱得到不含DNA的纯RNA。
试剂盒具有以下优点：
迅速稳定并保护RNA，确保基因完整、基因表达信息可靠。
由于RNA Stabilization试剂，您可以放心地在室温下操作，方便、安全--无须液氮和干冰。
确保RNA不受降解--即使多次冻溶也不受影响。
简单、快速和可靠RNA分离--使用于所有下游分析的即用型RNA。
货号 品名（规格） 价格（RMB）
74124
RNeasy Protect Mini Kit(50) 3181.00
75152
RNeasy Protect Midi Kit(10) 1313.00
75182
RNeasy Protect Maxi Kit(12) 4140.00
76104
RNAlater RNA Stabilizationeagent 682.00
* QIAGEN RNeasy Total RNA纯化系列（Affymetrix推荐！）
采用QIAGEN著名的硅胶膜纯化柱技术，迅速特异地吸附样品裂解液中的RNA，无需酚氯仿抽提，不用乙醇沉淀或LiCl沉淀，也不用CsCl超离，只要20分钟（Mini
Kit）到1小时（Maxi Kit）即可直接从样品中提取高质量的Total RNA。以下是部分产品信息，更大的包装信息或者详细操作手册欢迎致电基因有限公司或者点击产品名称查看。
货号 品名（规格） 价格（RMB）
74104
RNeasy Mini Kit (50)
75142
RNeasy Midi Kit (10)*
75162
RNeasy Maxi Kit (12)*
74903
RNeasy Plant Mini Kit (20)
* QIAGEN Oligotex Direct mRNA纯化系列 （Affymetrix推荐！）
Direct系列产品无需酚氯仿抽提，不用乙醇沉淀或LiCl沉淀，也不用CsCl超离，不到30分钟可直接从样品中纯化出高质量的mRNA，可用于各种常规应用以及芯片分析，显微注射，建库，消减杂交，SAGE技术等要求很高的的实验。回收率高达90%以上。以下是部分产品信息，更大的包装信息或者详细操作手册欢迎致电基因有限公司或者
到生物通商城查询。
货号 品名（规格） 价格（RMB）
72012
Oligotex Direct mRNA Micro Kit
72022
Oligotex Direct mRNA Mini Kit
72041
Oligotex Direct mRNA Midi/Maxi Kit
70022
Oligotex mRNA Mini Kit
70042
Oligotex mRNA Midi Kit
70061
Oligotex mRNA Maxi Kit
* QIAamp RNA Blood Mini Kit
专为从新鲜全血中快速提取高质量的RNA而设计，专利设计的QIAshredder和QIAamp离心纯化柱让你彻底摆脱酚氯仿抽提和离心沉淀的苦恼，简便快速地纯化出适用于各种用途的优质RNA。
QIAamp Viral RNA Mini Kit则适用于从各种无细胞的体液、血清、尿液、CSF中分离RNA，回收率高达90%以上。
货号 品名（规格） 价格（RMB）
52304
QIAamp RNA Blood Mini Kit(50)
52904
QIAamp Viral RNA Mini Kit (50)
* Clontech公司的Atlas Glass Total RNA Isolation
Kit是专为Clontech公司的Atlas Glass
Microarray设计的RNA纯化试剂盒。由于Clontech公司认为离心柱式的RNA纯化系统纯化的样品RNA在制备探针会在Atlas
Glass Microarray上有较高的背景，因而特别设计用硫氰酸胍/酚抽提制备适用于Atlas Glass Microarray样品RNA以便进行下一步的荧光/同位素标记。
2. Genomic DNA的分离纯化：
对于Genotyping、SNP分析和Genomic Chip来说，要检测基因组或者染色体上的突变就需要制备样品的基因组DNA而非RNA以进行检测。在这里简单介绍几个常用的试剂盒，有关详细资料和操作手册欢迎致电基因有限公司或到生物通商城查询。
* QIAamp System（Affymetrix推荐！）
QIAGEN公司专利的样品纯化技术方便快速从多种临床样品中纯化高质量的Genomic DNA，无需酚氯仿抽提和乙醇沉淀。根据不同的样品来源可以选择特定的试剂盒。
货号 品名（规格） 价格（RMB）
51104
QIAamp DNA Blood Mini Kit(50)
51183
QIAamp DNA Blood Midi Kit(20)
51192
QIAamp DNA Blood Maxi Kit(10)
51304
QIAamp DNA Mini Kit(50)
51504
QIAamp DNA Stool Mini Kit(50)
DNeasy System 是QIAGEN公司为除临床样本以外的其他样本，如动物组织、血液、酵母、细菌、植物等快速制备基因组DNA而设计的，采用硅胶膜技术，无需酚氯仿抽提和乙醇沉淀。单个离心柱或96孔纯化板满足不同的需求。
欢迎直接到生物通商城查询更多有关产品的信息.
货号 品名（规格） 价格（RMB）
69504
DNeasy Tissue Kit(50)
69103
DNeasy Plant Mini Kit(20)
69104
DNeasy Plant Mini Kit(50)
68161
DNeasy Plant Maxi Kit(6)
3. 探针的制备和标记：
对于表达芯片分析，常用的有以下几种方法制备和标记探针：将纯化的样品RNA通过特定的引物逆转录合成单链cDNA探针，在合成的过程中掺入标记物；或者先将待测样品的RNA转录合成cDNA，再进一步通过加入标记物进行体外转录合成cRNA单链探针，又或者将合成的cDNA加标记物和特殊引物进行PCR扩增，制备成标记的双链探针。而对于SNP芯片和突变检测，则需要将纯化的基因组DNA用特定的引物扩增并进行标记。由于不同的DNA
Array供应商对于标记有不同的要求，我们在下面分别介绍。
1）Affymetrix的表达芯片：
要求制备样品的cRNA探针。为保证制备出足够的cRNA用于杂交和每一步的样品分析，Affymetrix公司推荐用1μg以上的mRNA（最少0.2μg以上）或者5μg以上的总RNA开始合成cDNA。以HPLC纯的T7-(dT)24
Primer(推荐选用GENSET公司的产品，要求是HPLC纯的，PAGE胶纯化的引物在这里不适用)作为逆转录引物合成cDNA。由于引物中带有T7序列，因此合成的cDNA的3'端也带有T7序列。选用Affymetrix公司提供的Enzo?
BioArray? HighYield? RNA Transcript Labeling Kit(Cat.No.900182,10次标记)，通过试剂盒提供的生物素标记的核糖核酸和T7
RNA聚合酶，以体外转录（IVT）的方式扩增并标记cRNA探针。试剂盒提供体外转录和标记的所有试剂，可以作10个反应。标记好的探针经过随机片断化（fragmentation，试剂自行配制）后得到大小约为35-200个碱基大小的RNA片断即可和芯片进行杂交。
2）Affymetrix公司的Genotyping（如人类SNP图谱分析芯片）和健康研究芯片：
这一类芯片用于检测样品基因组的变异，因而只需纯化基因组DNA，并用配套的Primer进行PCR扩增。HuSNP的配套试剂盒里还提供标记好的引物。而对应2种健康研究芯片，Affymetrix公司则提供Enzo?
BioArray? Terminal Labeling Kit进行末端荧光标记。
3） Clontech公司的Atlas?Pure Total RNA Labeling
System：
这是一个从Total RNA中制备同位素标记的cDNA探针的试剂盒。利用生物素偶联的Oligo（dT）和磁珠偶联的Streptavidin将mRNA吸附到磁珠上，加入MacroArray（包括尼龙膜基质和塑料基质）提供的基因特异引物混合物（CDS
Primer）、同位素标记物和逆转录酶，直接在磁珠上合成同位素标记的cDNA探针，最后从磁珠上洗脱标记好的探针，纯化后即可用于杂交。这个标记试剂盒可以从少至10μg的total
RNA中制备适用于Clontech公司各种尼龙膜基质和塑料基质MacroArray的高质量cDNA探针。由于将mRNA纯化和cDNA探针合成、标记合为一体，方便用户的同时还可节约成本。这个系统不适用于玻片芯片的探针标记。
4） Clontech公司的SpotLight? Chemiluminescent
System
这种专为Clontech公司各种尼龙膜基质的Macroarray设计的化学发光试剂盒助你彻底从同位素中解放出来，让你轻松快速、高灵敏度地进行各种尼龙膜基质的杂交印迹和MacroArray的非放射性检测。两种标记试剂盒（Atlas
SpotLight Labeling Kit和SpotLight Random Primer Labeling Kit）适应不同的研究需要，配合通用的杂交检测试剂盒（SpotLight
Chemiluminescent Hybridization & Detection Kit），即可组合出完整的非放射性检测分析系统。不过这个系统不适用于玻片基质的芯片的探针标记。
由于Atlas系列的DNA微阵列膜上每个点的核酸量有限，所以对标记探针的灵敏度要求非常高，一般情况下同位素是首选。如今Atlas SpotLight标记试剂盒特别提供逆转录所需的试剂，可以将2μg以上的mRNA或者50μg以上的RNA样品制备成生物素标记的单链cDNA探针，由于没有竞争性抑制，单链探针的灵敏度要大大高于双链探针。另外生物素标记的探针比32P标记的探针要稳定，可以在半年内多次重复使用。
对于Southern、Northern和多组织Northern预制杂交膜（MTN）、多组织表达矩阵（MTE）等以尼龙膜为基质的杂交、印迹反应，可以选用SpotLight随机引物标记试剂盒进行标记，和同位素标记一样简单，但却更加安全、容易处理，而且生物素标记的探针稳定时间更长。
配套通用的杂交检测试剂盒里提供特殊配方的SpotHyb杂交液，能有效降低背景，减少非特异杂交，提高灵敏度。HRP偶联的Streptavidin能高效专一地结合生物素标的探针。采用了加强型的化学发光试剂，信号强且发光信号可以持续6小时之久，通常压片5-10分钟，一旦结果不理想，允许反复压片。相比同位素需要压片过夜，SpotLight让你当天就得到实验结果，可谓安全、方便、快速多了；而相比常规化学显色法，SpotlLight化学发光法的灵敏度要高的多，信号更清晰、干净，而且不会出现一旦显色过度就不可逆转的毛病。
5) Clontech Atlas?Glass Fluorescent Labeling Kit
这是一个间接荧光探针标记试剂盒，标记好的荧光探针适用于各种玻片基质的DNA芯片。在试剂盒提供的dNTP Mix中以氨基化的dUTP（Aminoallyl-dUTP）代替普通的dUTP（这种修饰不影响合成效率），加入2μg以上的样品mRNA或者20μg以上的total
RNA，以及基因特异性引物（一般由芯片试剂盒提供）和逆转录酶，合成氨基修饰的cDNA。这时只要加入N-羟琥珀酰亚胺（N-hydroxysuccinimide）活化的荧光染料（自备）进行偶联反应，荧光染料的活化基团就会和cDNA中的修饰dUTP上的氨基偶联，从而生成荧光标记的cDNA探针。荧光染料可以是Cy3、Cy5、FITC、fluorescein、Texas
red、rhodamine、bodipy或者Alexa dye，而且各种荧光染料的标记效率相当。值得一提的是这种间接荧光标记比直接标记法的效率更高，在双色荧光标记时，可以避免直标法因为Cy5标记效率低而导致Cy3、Cy5两种颜色信号强度不同的现象。试剂盒提供除荧光染料外的全部试剂，足够作10次标记。
6）Vysis公司的Microarray Nick Translation Kit是配合Vysis公司的Genomic Microarray--AmpliOnc
I Microarray的荧光标记试剂盒，采用缺口平移的方法将荧光标记的dUTP掺入纯化的样品基因组DNA中作为探针，和AmpliOnc
I Microarray进行杂交。
除了厂家为自家的DNA Array提供的配套核酸纯化和标记试剂盒,我们还介绍几个比较有特色的同类产品：
4．用于多次反复杂交的可洗脱探针制备技术：
Ambion公司的Strip-EZ RT Kit是专门为尼龙膜基质的Macroarray，以及各种预制杂交膜而设计的cDNA探针合成标记试剂盒。我们在前面介绍过尼龙膜基质或者塑料基质的Macroarray的优点之一是在杂交检测后可以将膜上结合的探针洗脱，因而膜可以重复使用多次，能够一定程度的降低每一次的使用成本。常规的膜再生方法需将膜放在SDS溶液中煮沸一定时间，因而会对膜和膜上的信号造成损耗，通常重复使用3次后已经得不到清晰的信号。
Strip-EZ RT试剂盒的工作原理是在逆转录酶合成cDNA探针的同时掺入经修饰过的脱氧核苷酸（专利技术，这种修饰不会影响探针的杂交特性）和标记核苷酸，合成的探针与膜经过杂交、检测后将膜浸入Probe
Degradation Buffer中5分钟，修饰过的脱氧核苷酸降解，探针即被降解寡核苷酸碎片，再将膜浸入再生Buffer中68℃下温和地洗脱降解的寡核苷酸碎片，膜即可再生。Strip-EZ
RT Kit制备的cDNA探针可以在非常温和的条件下（试剂由试剂盒提供）洗脱原有的杂交信号，减轻对膜的伤害，延长膜的使用寿命，降低膜的使用成本。数据表明经过9-15次反复洗脱后的膜依然能得到清晰的杂交信号(见图，左边为STRIP-EZ标记探针，右边为普通探针，膜经过1，3，5，10，15轮反复杂交-洗脱-再杂交后检测信号）这个试剂盒可用于同位素标记和非放射性标记，需要0.5-1μg以上的mRNA或者10μg以上的total
RNA作为起始材料，不过厂家推荐尽可能的使用纯化的mRNA，因为使用total RNA会导致较高的非特异背景，影响检测。
Ambion公司针对不同厂家的Macroarray还推出了优化条件的专用试剂盒Array-Advantage AA Kit （Cat.No. 1857，for Clontech's Atlas™ Nylon Array)， Array-Advantage GF Kit (Cat.No. 1855, for Research Genetics' GeneFilters® Array， Array-Advantage UA Kit （Cat.No.1853, for Ambion's ULTRArray)。除了Strip-EZ RT所需试剂外，这种试剂盒里还提供探针纯化柱（30），可以除去探针中多余的标记物和杂质，同时还提供适用于尼龙膜的快速杂交液（500ml）、20xSSC（1L）、10%SDS（1L）等试剂和需要用到的指管。对于需要RNA探针或者DNA探针的用户，Strip EZ还有RNA、DNA和PCR三种不同的试剂盒可供选择，详情请致电基因有限公司或访问生物通商城。
以上各种方法都要求较大量的起始材料（通常要1μg以上的mRNA），对于那些数量很少的样品该怎么办呢？对于细胞数量不少于1000或者质量不少于100μg的样品，可以选用Clontech公司的SMART PCR cDNA Synthesis Kit（K1052—1）结合Atlas SMART Probe Amplification Kit。SMART技术是利用逆转录酶在逆转录反应过程中遇到mRNA5’端帽子结构时会自动加若干个dCTP的特性，在反应体系中加入末端带若干个G的SMART Oligonucleotide与之形成匹配，使逆转录酶以SMART引物为模板继续延伸合成的cDNA，从而使合成的cDNA5’端带上SMART引物的对应序列，就可以直接用PCR进行扩增。因此只要少至50ng的total RNA就可以通过扩增得到足够的材料来合成探针。扩增后的cDNA加入基因特异性引物（如果没有，可以用随机引物，但会导致背景升高和灵敏度降低）、Klenow酶、SMART Blocking Solution和标记物合成cDNA探针。这个SMART Blocking Solution可以阻断前面的SMART引物，避免对后继的探针合成和杂交产生影响。SMART技术经过优化后可以保证扩增后的cDNA基本保持原始RNA样品的复杂度和相对丰度，因而合成的探针也保持同样的代表性。
对于更少的样品，比如用Laser Capture Nicrodissection激光显微俘获系统从组织切片上挑选的少量细胞或者手术切下的较小的组织块（例如活组织检查切片），则可以考虑以下方法：用带有T7序列的Oligo（dT）和特别灵敏的QIAGEN Sensiscript RT Kit（适用于特别少量的RNA样品，如单细胞RT-PCR）将样品RNA反转录为带T7序列的cDNA，再用Ambion公司的MEGAscript High Yield Transcription Kit进行体外转录，大量扩增mRNA后再用不同的方法制备探针。Ambion公司专利的大规模合成RNA技术可以在较短时间内合成大量RNA，其产量为常规方法的10—50倍，最长可以合成常达16kb的转录本，特别适合少量样品中低丰度的RNA扩增。另外也可以选择Ambion公司的Cell-to-cDNA试剂盒，则可以避免少量样品抽提RNA的麻烦，通过细胞裂解、RNAse失活和DNAse消化到cDNA合成，直接合成cDNA，然后再配合MEGAscript High Yield Transcription Kit扩增RNA，最后标记探针。
另外，由于标记后需要去除标记反应中的杂质和未掺入的标记物才能进行杂交，我们在这里另外介绍几个纯化探针的产品：
QIAGEN公司的QIAquick Nucleotide Removal Kit（Cat.No.28304,
50preps）独特的硅胶膜技术能够在5分钟内纯化10μg从17mer—40mer的单链DNA或者40bp—10kb的双链DNA，能去除99%以上的<10mer的寡核苷酸或者dNTP。特别适合去除同位素标记反应中的未掺入的标记物。
Ambion公司的NucAway Spin Columns（Cat.No.10070，30preps）一步离心即可有效去除未掺入的标记物和盐，特别适合探针纯化，保证无RNase、DNase污染。
Clontech公司的CHROMA SPIN?Column（Affymetrix推荐！）是一类预装微型凝胶过滤柱，用时只要拆开两端密封，离心--上样--离心，即可有效去除样品中的小分子杂质，3种不同的缓冲液适合不同需要：TE
Buffer适合常规的DNA纯化，STE（TE+0.1M NaCl）适合需要较高盐浓度以防止样品分子间的离子相互作用，而DEPC-H2O（+0.1M
EDTA）适合RNA的纯化。每一种缓冲液均有6种不同的型号，根据凝胶孔径的不同，分离样品的范围可从15mer到Genomic DNA。
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产品 |
应用 |
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K1300-1
CHROMA SPIN+STE-10 Columns（20） |
去除未掺入的核苷酸；去除5 kDa的小分子；核酸反应中脱盐或换Buffer；纯化>15mer的寡核苷酸 |
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K1301-2
CHROMA SPIN+STE-30 Columns（50） |
纯化>35mer的DNA或者RNA分子，在标记或合成cDNA反应中除去<9mer的小分子、盐和dNTP，去除连接反应中的Linker；纯化>30 kDa的蛋白 |
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K1302-1
CHROMA SPIN+STE-100 Columns(20) |
纯化>140bp的DNA或者140碱基的RNA分子；除去PCR反应后未延伸的Primer或者<30bp的短扩增产物；在转录和DNase消化DNA模板后纯化>140mer的RNA探针；除去消化后的琼脂糖成分；从DNA或者RNA溶液中除去<250 kDa的蛋白； |
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K1325-2
CHROMA SPIN+TE-200 Columns 50 |
PCR反应后纯化>350bp 的DNA分子；除去<50mer的引物和<45bp的引物双体；除去<1000kDa的蛋白 |
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K1323-2 CHROMA SPIN+TE-400 Columns 50 |
纯化或者筛选>600bp的DNA分子；从>600bp的PCR产物中除去<100bp的引物和扩增产物；除去<8000kDa的蛋白 |
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K1334-1
CHROMA SPIN-1000 DEPC-H2OColumns(20) |
纯化>1350bp的DNA分子；纯化lambda DNA、酵母基因组DNA和其他大分子；从质粒中去除各种蛋白和RNA；除去<500bp的cDNA |
另外，有的研究人员习惯用酚氯仿抽提纯化核酸，除了对人体有害，酚氯仿抽提的另一个问题是：为避免将中间层的蛋白杂质或有机相连同上清一起吸出，往往需要弃去一部分上清不要，这种情况会造成相当一部分样品损失，特别是小体积的酚抽提。所以我们在这里介绍一个新产品，相信大家一定会喜欢：Eppendorf公司的Phase Lock Gel（Affymetrix推荐！）只要将酚氯仿和样品的混合物加入预装有Phase Lock Gel的管子里，离心，这种专利的化合物就会在水相和有机相之间形成一层致密的固体，将中间层的蛋白杂质和下层有机相完全锁在固体之下，你可以轻松的吸出全部水相样品，提高回收率而不用担心混入杂质，也不用担心酚氯仿会不小心流出来。对于大体积的样品抽提，还可以直接将全部水相倒出而有机相依然被牢牢“锁定”在管底不会流出。Phase Lock Gel不会影响常规的酶反应，你可以在装有Phase Lock Gel的管子里进行酶切，加热失活，再进行酚抽，离心后酚被锁在固相之下，再直接加入酚氯仿抽提，再离心，Phase Lock Gel会重新在新的水相和有机相之间形成固体，将全部有机溶液锁在固体层之下，相当方便。Phase Lock Gel分为PLG Heavy和PLG Light两种，前者适用于碱法提质粒、RNA抽提等杂质较多（粘稠）的情况（不适合纯酚抽提），后者适用于酶切反应、cDNA合成、标记反应和常规组织Genomic DNA纯化（Mouse tail除外），适用于纯酚、酚氯仿、氯仿抽提。
互补杂交要根据探针的类型、长度以及研究目的来选择优化杂交条件。如用于基因表达检测，杂交时需要高盐浓度、样品浓度高、低温和长时间(往往要求过夜)，但严谨性要求则比较低，这有利于增加检测的特异性和低拷贝基因检测的灵敏度；若用于突变检测，要鉴别出单碱基错配，需要故需要在短时间内(几小时)、低盐、高温条件下高严谨性杂交。多态性分析或者基因测序时，每个核苷酸或突变位都必须检测出来，通常设计出一套四种寡聚核酸，在靶序列上跨越每个位点，只在中央位点碱基有所不同，根据每套探针在某一特点位点的杂交严谨程度，即可测定出该碱基的种类。
杂交反应还必须考虑杂交反应体系中盐浓度、探针GC含量和所带电荷、探针与芯片之间连接臂的长度及种类、检测基因的二级结构的影响。有资料显示探针和芯片之间适当长度的连接臂可使杂交效率提高150倍。连接臂上任何正或负电荷都将减少杂交效率。由于探针和检测基因均带负电荷，因此影响他们之间的杂交结合，为此德国癌症研究院的Jorg
Hoheisel等提出用不带电荷的肽核酸（PNA）做探针效果更好。虽然PNA的制备比较复杂，但与DNA探针比较有许多特点，如不需要盐离子，因此可防止检测基因二级结构的形成及自身复性。由于PNA-DNA结合更加稳定和特异，因此更有利于单碱基错配基因的检测。我们在这里简单介绍一些常用杂交试剂和消耗品
对于商品化的芯片和Array类产品，通常都有配套的杂交试剂以方便使用。例如：
1.
Clontech公司的Altas Glass Microarrays，产品已经包含GlassHyb™ Hybridization
Solution和GlassHyb™ Wash Solution，能有效缩短杂交时间，提高信噪比。同时还提供了方便使用的Altas
Glass Hybridization Chamber，旋盖式的设计和1.8ml的容积，避免了传统coverslip式杂交盒的弊端。可以单独购买。
7899-1 Altas Glass Hybridization Chamber each
8016-1
GlassHyb™ Hybridization Solution 50ml
2.
Clontech ExpressHyb Hybridization Solution快速杂交液能有效加快杂交速度，减少杂交时间，同时提高灵敏度。适用于各种基于膜的核酸杂交反应，如cDNA
Array、Southern、Northern、菌落原位杂交，特别是Clontech公司的Altas系列、MTN系列、MTE系列的各种膜基质的Macroarray。在
这些系列的产品中均配有快速杂交液样品。由于膜可以反复使用，通常需要另外购买快速杂交液。
8015-1 ExpressHyb Hybridization Solution 250ml
8015-2
ExpressHyb Hybridization Solution 500ml
3.
对于自己制作的芯片，可以自行配置杂交缓冲液，也可以参考Ambion公司提供的几种Glass Array 杂交缓冲液。SlideHyb™
Glass Array Hybridization Survey Kit是专为玻片或者尼龙膜基质的玻片DNA Array优化杂交条件而设计的。由于芯片的杂交条件受多种因素的影响，Ambion认为很难找到一种适用于所有芯片的杂交缓冲液。在这个试剂盒中提供了4种严谨程度不同的杂交液，供不同的需要。1号缓冲液的杂交条件是最严谨的，背景最低，2、3号的灵敏度相应提高而背景也相应升高，4号缓冲液没有去垢剂。这些杂交液可以单独购买，连预先配好的SDS、SSC等常用缓冲液都可以在Ambion买到。毕竟在芯片这样精密的实验中，在这么小的一个点上的DNA的量是非常有限的，要得到理想的结果需要非常精确的反应条件。Ambion
同样提供芯片杂交盒，抗化学腐蚀，耐70度高温，一次可放三张片。
Cat.No. Product Name Size
1860 SlideHyb™GlassArray
Hybridization Survey Kit 100rxns
8861
SlideHyb™ Glass Array Hybridization Buffer#1 5 x 2 ml
8862
SlideHyb™ Glass Array Hybridization Buffer #2 5 x 2 ml
8863
SlideHyb™ Glass Array Hybridization Buffer #3 5 x 2 ml
8864
SlideHyb™ Glass Array Hybridization Buffer #4 5 x 2 ml
10040
Glass Array Hybridization Cassette 1 each
4. Ambion同样提供适用于各种核酸膜杂交的杂交液和Wash Buffer，精心优化的反应条件有效提高杂交灵敏度和降低背景，已经经过ULTRArray™
(Ambion), Atlas™(Clontech)，LifeGrid™ (Incyte Genomics),
GeneFilter® (Research Genetics), and Panorama™ (Sigma-Genosys)
arrays等产品验证。
Cat#
ProductName
Size
7118
Yeast RNA
10 x 10 mg/ml
8665
ULTRArray™ Hybridization Buffer
225 ml
8666
ULTRArray™ Hybridization Buffer
500 ml
8667
ULTRArray™ Low Stringency Wash Buffer
1 L
8668
ULTRArray™ High Stringency Wash Buffer
1 L
9680
Salmon Sperm DNA (sheared)
10x10 mg/ml
9763
20X SSC 1 L
9765
20X SSC 4 x 1 L
9780
RNaseZap®
250 ml
当生物芯片和样品探针杂交完毕后，就需要对杂交结果进行图象采集和分析。一般膜芯片的杂交都用同位素p32、p33作标记，其信号的检测需通过传统的磷光成像系统来完成。而对于用荧光标记的玻璃芯片杂交后的检测，则需要用专门的荧光芯片扫描仪。
1.
磷感屏成像系统Cyclone Storage Phosphor System
Cyclone磷屏成像系统为美国Packard公司生产的第一台集高分辨率、高灵敏度和5个数量级的线性范围于一身的计算机控制数字化自动放射成像分析系统，由于其使用方便、快捷、自动化程度、分辨率、图像清晰度均很高，既可定位亦可定量，目前已广泛应用于核医药学、细胞与分子生物学、生物化学、药理学、基因工程学、药物代谢动力学、放射免疫及受体免疫等多方面实验研究，成为十分方便的有力工具。其优异品质主要得益于Packard专利的激光技术和共聚焦成像系统。应用范围为我们前面介绍的DNA
Macroarray以及Northern、Southern、Western Blot.，手工测序，放射性原位杂交等的同位素结果检测。使用Cyclon磷屏可以大大缩短研究周期，获得清晰的分辨率。
其工作原理在于：同位素标记的杂交结果在磷屏上曝光，曝光过程32P等核素核衰变同时发射β射线，首先激发磷屏上分子，使磷屏吸收能量分子发生氧化反应，以高能氧化态形式储存在磷屏分子中。激光扫描磷屏，对于激发态高能氧化态磷屏分子发生还原反应，即从激发态回到基态时多余的能量以光子形式释放，从而在PMT捕获进行光电转换，磷屏分子回到还原态。计算机接受电信号，经处理形成屏幕图像，并进一步分析和定量。一般化学发光物质如荧光染料标记样品成像过程与放射性类似。
系统特点
放射性自显影成像系统。储存式磷屏根据不同样品厚度、射线能量有多种型号磷屏可供选择，磷屏可以多次重复使用。
灵敏度较X光片高数十倍，可以检测最弱的信号。曝光时间可以缩短20倍以上。
快速成像，从对磷屏进行扫描到获得完整的的数字化图像，总共需要不到10min的时间，实时图像显示，同时立即报告分析结果。
可对放射性位置和强度进行相关的定位、定量分析，宽达105的线性范围，定量准确。
不需胶片、暗室设备、冲洗底片，一步到位完成分析过程。
可选配Ouant ArrayTM
软件，用于尼龙膜上同位素标计的Gene Array定量分析。
2. 荧光芯片扫描仪
由于杂交时产生序列重叠，会有成百上千的杂交点出现在图谱上，形成极为复杂的杂交图谱。序列重叠虽然可为每个碱基的正确读出提供足够的信息，可提高序列分析的可靠性，但同时信息处理量也大大增加了。一般说来，这些图谱的多态性处理与存储都由专门设计的软件来完成，而不是通过对比进行人工读谱。用计算机处理即可给出目的基因的结构或表达信息。扫描一张10cm2的芯片大概需要2-6分种的时间。目前专用于荧光扫描的扫描仪根据原理不同大致分为两类：一是激光共聚焦显微镜的原理,
是基于PMT（photomultiplier tube，光电倍增管）的检测系统（另文介绍）；另一种是CCD（charge-coupled
devices，电荷偶合装置）摄像原理检测光子。CCD一次可成像很大面积的区域，而以PMT为基础的荧光扫描仪则是以单束固定波长的激光来扫描，因此或者需要激光头，或者需要目的芯片的机械运动来使激光扫到整个面积，这样就需要耗费较多的时间来扫描；但是CCD有其缺点：目前性能最优越的CCD数字相机的成像面积只有16×12mm（像素为10μm），因此要达到整个芯片的面积20×60mm的话，需要数个数码相机同时工作，或者也可以以降低分辨率为代价来获得扫描精度不是很高的图像。由于灵敏度和分辩率较低，比较适合临床诊断用。
生产商业化扫描仪的公司包括：Genomic Solutions公司、Packard公司、GSI公司、Molecular Dynamics、Genetic
Microsystems公司、Axon ?Instruments公司等。其中GSI Lumonics 公司ScanArray 系列一直是生物芯片扫描检测系统中的领头产品。2000GSI并入著名的Parkard公司后ScanArray的软、硬件都得到进一步加强。
ScanArray利用其专利的激光共聚焦光学系统，通过计算机控制，对生物芯片的荧光杂交信号进行全自动的扫描采集，并通过分析软件对数据结果进行定量分析。
最高灵敏度高：<0.1荧光分子/μm
扫描精度可从5μm-50μm分级调整
全范围扫描时间仅需5分钟，快速方便
多达十种检测滤光片，涵盖所有生物芯片荧光染料的检测，适用于多种荧光标记探针
不同波长依次扫描避免交叉光污染
扫描后的图像还需要进一步的处理，这要求一定的软件支持。现有的分析软件包括：Biodiscovery的ImaGene系列，Axon Instruments的GenePix系列，GSI的QuantArray等
3. 基因芯片上各克隆荧光信号的分析原理
用激光激发芯片上的样品发射荧光，严格配对的杂交分子，其热力学稳定性较高，荧光强；不完全杂交的双键分子热力学稳定性低，荧光信号弱（不到前者的1/35~1/5），不杂交的无荧光。不同位点信号被激光共焦显微镜，或落射荧光显微镜等检测到，由计算机软件处理分析，得用激光激发芯片上的样品发射荧光，严格配对的杂交分子，其热力学稳定性较高，荧光强；不完全杂交的双键分子热力学稳定性低，荧光信号弱（不到前者的1/35~1/5）（2），不杂交的无荧光。不同位点信号被激光共焦显微镜，或落射荧光显微镜等检测到，由计算机软件处理分析，得到到有关基因图谱。美国GSI
?Lumonics 公司开发出专专业基因芯片检测系统(ScanArray 系列),采用激光共聚焦扫描原理进行荧光信号采集，由计算机处理荧光信号，并对每个点的荧光强度数字化后进行分析。利用QuantArray软件包对扫描的荧光信号进行分析，比
较每个克隆在不同组织间表达水平的差别。软件具体分析步骤如下：
首先，同时导入同一区域两个channel扫描的图像文件；将两个channel扫描的图像用不同的颜色显示并重叠；选择拟分析的区域，输入矩阵的行数及列数以及矩阵的个数等参数；在计算机给出的该区域信号图片上标定网格，使得网格中所包含的横线和竖线的交点个数同每个区域点样的克隆数相同，调整网格，使每个交点均位于点样克隆信号的中心；信号的中心确定后，计算机将自动以交点为中心，按照设定的半径圈定各克隆，并将其内部区域作为待分析的信号，同时在圈定的各克隆周围再按照预设的值圈定一定范围的区域，将该区域内的信号作为背景噪音；计算机分析每个克隆扣除背景噪音后的信号强度，并按照不同的要求对数据进行分析；利用GenePie方式对两个channel信号的进行定量比较分析，此时计算机根据各克隆两个channel扫描的信号，以饼图的形式给出两个channel信号强度的相对比例，同时可以逐个克隆读取计算机分析出的两个channel信号的值及所占的比例，进而确定各克隆在两种组织间的表达差异。
4. Microarray数据分析
Microarray数据分析简单来说就是对Microarray高密度杂交点阵图象处理并从中提取杂交点的荧光强度信号进行定量分析，通过有效数据的筛选和相关基因表达谱的聚类，最终整合杂交点的生物学信息，发现基因的表达谱与功能可能存在的联系。
Microarray数据分析主要包括图象分析(Biodiscovery Imagene 4.0\Quantarray分析软件)、标准化处理（normalization）、Ratio值分析、基因聚类分析（Gene
Clustering）。
1. 图象分析：激光扫描仪Scaner得到的Cy3/Cy5图象文件通过划格（Griding），确定杂交点范围，过滤背景噪音，提取得到基因表达的荧光信号强度值，最后以列表形式输出。
2. 标准化处理（Normalization）：由于样本差异、荧光标记效率和检出率的不平衡，需对cy3和cy5的原始提取信号进行均衡和修正才能进一步分析实验数据，Normalization正是基于此种目的。Normalization的方法有多种：一组内参照基因（如一组看家基因）校正Microarray所有的基因、阳性基因、阴性基因、单个基因。
3. Ratio分析(Ratio Analysis)：cy3/cy5的比值，又称R/G值。一般0.5-2.0范围内的基因不存在显著表达差异，该范围之外则认为基因的表达出现显著改变。由于实验条件的不同，此域值范围会根据可信区间有所调整。处理后得到的信息再根据不同要求以各种形式输出，如柱形图、饼形图、点图、原始图象拼图等。将每个Spot的所有相关信息如位标、基因名称、克隆号、PCR结果、信号强度、Ratio值等自动关联并根据需要筛选数据。每个Spot的原始图象另存文件，可根据需要任意排序，得到原始图象的拼图，对于结果分析十分有利。
4. 聚类分析(Clustering Analysis)：实际是一种数据统计分析。通过建立各种不同的数学模型，可以得到各种统计分析结果，确定不同基因在表达上的相关性，从而找到未知基因的功能信息或已知基因的未知功能。Gene
Clustering就是根据统计分析原理，对具有相同统计行为的多个基因进行归类的分析方法，归为一个簇的基因在功能上可能相似或关联。目前以直观图形显示GeneCluster结果的程序已有人开发出来，可将抽象的数据结果转化成直观的树形图，便于研究人员理解和分析。
尽管基因芯片技术受到了广泛关注，但在基因表达谱分析中起着关键作用的生物信息学却没能引起大家的足够重视，认为简单人工处理一下原始数据就可以得到有价值的生物学信息，大量有价值的信息就这样被浪费和湮没了。可以肯定地说，没有生物信息学的有效参与，基因芯片技术就不能发挥最大效能。加大基因芯片技术中生物信息学的研究开发力度已成为当务之急。国内外已经进行了有益的尝试，初步开发出供芯片平台管理实验数据的软件包，就目前实际情况来看，生物信息学在基因芯片研究开发中介入的程度已经越来越深，主要涉及基因表达信息分析管理系统及其分析工具和分析方法，简单概括为以下几个方面：
基因表达数据库
基因表达数据库是整个基因表达信息分析管理系统的核心。Microarray数据库起着数据储存和查询、各种相关信息的整合的作用。Microarray数据库可以包含用户的管理信息、原始实验结果（图象文件、信号强度值、背景平均值行列号、基因号等）、各种实验参数（Plates/unigene/Sets/Clusters）、探针相关信息、
clone相关信息（基因名称、基因序列、GenBank accession号、克隆标志符（IMAGE和内部）、代谢途径标志符、内部克隆标志符）、分析处理结果、芯片设计相关的资源和数据，等等。
分析方法：
选择分析方法的基本标准：能够简化原始数据，结果直观，使研究者能在海量基因表达数据中解析出正确的基因表达谱和功能信息。一个理想的分析方法是建立在合理的算法基础之上的，应该能全面综合并直观地解析原始数据，修正已有数据，并从结构、序列、功能之间找到新联系。目前已有报道用于microarray数据分析的方法主要有以下几种：
手工分类法（Manual classification Method）
该方法在Botstein 实验室的Michael Eisen提出新的分析方法之前是唯一用来分析microarray数据的方法。其基本原理是通过对microarray的ratio值从大到小排序，筛出表达显著性改变的基因。结果可直观地从二维plot图得到。优点是能够有效筛选潜在的肿瘤标记基因和药物靶位点；可以构建多组基因诱导或抑制的时间表达谱。缺点是结论过于简单；很难发现更高层次功能线索；处理耗时且不能充分利用数据，也不能发现实验错误。
非监督聚类法(Unsupervised Clustering)又称配对平均连锁聚类分析(Pairwise average-linkage
cluster analysis)。该方法是分层聚类的一种形式，非常类似系统发生分析。该方法是基于标准相关系数的计算。K -mean方法是unsupervised聚类法的一个变化，目前Stanford
University 的Botstein实验室和NHGRI的Trent实验室都采用该分析方法。
混合聚类法(Hybrid clustering approach)该聚类方法通过将每一数据点傅立叶变换寻找那些表达呈周期性变化的基因，比如细胞周期涉及的基因。所谓混合聚类就是先unsupervised聚类再supervised聚类。优点是可以整合以前手工聚类法得到的数据；尤其适合确认细胞周期调控的特征性表达谱。
神经网络方法(Neural network approach)运用自组织图（Self organizing maps）并结合supervised法进行聚类。优点是分类标准明确；优化的次序好于其它聚类法；用一种次序风格处理大量数据易于被生物学家接受。
吴岚君
（北京放射医学研究所 100850）
所有的微阵列上的荧光须经荧光扫描装置来分析其上的荧光强度和分布，在这些装置中，激光共聚焦扫描仪具有优越的性能，能获取高质量的图像和数据，本文将分别介绍微阵列的相关特性和各种类型的微阵列扫描仪，激光共聚焦扫描仪的设计和关键特性，另外还将介绍一种已商品化的激光共聚焦荧光扫描装置。
微阵列是由分子整齐排列于固相表面，这些分子与荧光分子结合，测定荧光分子的强度后可推知结合分子的浓度。固相部分主要有经过表面化学处理的玻璃片如22mmχ75mm的载玻片。在微阵列上包被的分子常常能与多种荧光探针通过化学键相互作用而联结，通常情况下能联结两种荧光分子，例如在检测不同样品的基因表达的区别时，可将其中一样品（如正常组织）标记上发绿光的荧光分子，将另一种样品如肿瘤组织或发病组织标记上另一种发红光的荧光分子，用两种波长的激光激发微阵列上的样品，通过比较两种荧光在微阵列上某点的比例得知某类基因在两种组织中的差异。
微阵列上有样品组成的点阵，除了点之外，余下的是背景。如果玻璃片未经过表面化学处理，样品在玻片上结合不牢固，且容易扩散，造成背景高。若玻璃片经过表面化学处理后，点样的样品在微阵列上结合牢固，点的直径小，不扩散，从而点的密度增加，在进行荧光数据分析时，仪器将点上的荧光强度与点周围的背景强度相比较，如果背景中含有与荧光波段相一致的物质，则背景强度增高，样品的荧光信号将减弱，干扰信号的读取。
点阵上的点直径范围为25mm-500mm，通常目前能达到的直径为100mm±50，科学家们正在努力减小直径。因为点直径的变化对扫描结果的读取产生影响，如果点的直径大，荧光分子扩散的范围也大，则观察到的荧光强度相对较弱。
若在玻片上有灰尘或其它杂质如衣物纤维、皮屑、指纹等，扫描结果将受到影响。微阵列上的点干燥后形成很薄的层，使得激光共聚焦扫描成为可能，精心地调整扫描仪的焦距，可避免检测出不需要的背景杂质，包括微阵列上的灰尘、玻璃中自带的荧光杂质产生的干扰信号均可通过激光共聚焦的方式将其减少到最低程度。因为杂交因素影响，在微阵列上点与点之间的荧光强度差别很大。对微阵列扫描仪的要求要能够有较宽范围的灵敏度，通常来说，灵敏度调整范围为10000：1。
当荧光化合物或染料受到激光激发后将释放出荧光，在某一波长下有一最高释放强度。各种荧光化合物有各自特定的激发吸收值。如图1是FITC的波长对荧光激发强度曲线。从曲线图可见，在494纳米波长下，有一激发高峰，在518纳米下有一释放高峰，释放与激发高峰波长相差24纳米，这一现象在微阵列使用的染料中较普遍。两高峰波长的差值在专业上称之为Strokes shift, 初看曲线图人们可能会以为：FITC在510纳米的波长激发下，在475-510纳米范围内将释放部分荧光，其实并不尽然；释放波长一般情况下大于激发波长，在图中的激发曲线不是与释放曲线同时绘制的，将它们放在同一坐标图中是为了便于观看，其实它们是两套不同的数据。激发曲线的绘制过程如下：在单一长波长下，变换激发波长在不同波长下测定荧光释放强度，释放荧光曲线的绘制过程则是在最长激发波长下开始增加波长，测定在不同波长下的荧光释放强度。微阵列扫描仪设计者通过阅读和分析某中荧光染料的激发曲线和释放曲线来确定适合某种染料的复合扫描激发波长，该波长的激发效率至少要达到50-70%的水平。激发波长要避免太接近释放高峰对应的波长，否则荧光信号受到干扰。所以应在峰值的左边选择一激发波长。如对FITC来说，建议的激发波长在470-495nm.荧光释放强度在某一范围内，与激发光的强度成正比，当荧光释放达到最高峰后，增加激发光强度却不能提高释放强度，因为荧光释放已经达到饱和或光子将染料破坏淬灭。微阵列上各点的荧光分子受到激发后，从各个方向释放荧光光子，散射成球状，所以扫描仪须将这些散射的光子采集到，由于扫描仪的使用的是很低的释放光，几何球状是设计扫描设备的主要根据。
图1 FITC的波长对荧光激发强度曲线
微阵列扫描仪可有多种设计类型，但任何类型的微阵列扫描仪都有以下基本功能：
激发光
激发光的产生源有多种，如激光、氩灯、LEDs或钨丝灯。激发光的波长要避免将释放光的波长覆盖或重叠。对于LEDs或钨丝灯需用滤光器来选择某种特定波长的光。激光的波长单一不需要滤光器来选择某种特定波长的光。灯泡光源可产生多个波长的激发光，通过多个滤光器可选择多种特定的波长以满足激发不同荧光的需要。激发光应直接射向微阵列上的待测样品，通过大量一次照明的方式，待测样品的大部分区域同时受到激发，这种方式在CCD数码相机中较常见，该方式的缺陷是待测样品的受到得激发光不够均匀一致。这点是仪器设计者须考虑到的重要因数之一。另一种方式是：激发光聚焦于样品的很小部分，采用特定的光线采集和定位，聚焦点上的激发光光线密度较高，大约为10000watt/cm2。激发波长的选择是依据染料的激发曲线和释放曲线的峰值来确定的，在染料激发峰值的左边且激发效率较高的范围内，在某种染料水平下，激发效率越低，要达到某种光强，则需要向样品上发射的光越多。过多的发射光将通过光漂白作用破坏样品和污染干扰释放光的信号。
释放光采集
荧光由目镜的镜头来采集，该镜头聚焦于样品上并将一定区域内的光线收集到装置。收集的角度区域的大小非常关键，荧光释放是球形的，目镜对荧光的采集范围是决定仪器的采集效率关键指标之一。目镜采集光的角度由数值孔径来表示，图2表示了数值孔径与光采集效率之间的变化关系。当数值孔径为1.0时，目镜将收集到整个半球的光，相应的光采集效率为50%。在许多激光共聚焦微阵列扫描仪的数值孔径在
0.5-0.9, 而CCD-扫描仪的数值孔径为0.2-0.5。有其他类型的扫描仪不用目镜而是使用积分球面镜来采集释放的部分光源，但是部分光线经过多次球面反射而衰减。还有一些无散光收集装置，仅仅是将探测器放在样品的某一区域的上方，光线采集的效率受限于样品被照明处的范围及探测器的视角，例如，一个直径为25mm的探测器放在激发点上方100mm处，其实际的有效数值孔径为0.12。图2显示目镜的不同数值孔径与光采集效率的关系。
图2 目镜的不同数值孔径与光采集效率的关系
空间定位
是指对样品上的某一小区域上的荧光信号进行荧光强度计算，微阵列上的各点样品被分割为许多微小的像素，在进行荧光信号定量时，空间分辨率必须高于个点的大小，如微阵列上各点的直径为100mm，则像素的大小为5-20mm。空间定位可通过多元素探测器，如CCD或机械扫描装置。许多相机设置为大范围照明，探测器直接提供由许多像素组成的图象，该方法的缺陷是CCD提供的目镜数值口径较小，后方照明及维持系统冷却设备价值昂贵，由于光散射会导致像素之间交叉重叠造成信号不够清晰。机械扫描过程包括以下几个步骤：将激发光束聚焦于某一大小同像素差不多的点上，用单一元素的探测器采集那一小点上的释放光。要将整个样品扫描完全，则需移动样品或用一微小的反光镜使激光束移动扫描样品。虽然扫描装置增加了机械装置的复杂程度，但比起CCD相机来，机械扫描可达到的数值孔径更高，有更好的空间选择性，探测器也较便宜些。在低强度的光源下，高光线采集率是至关重要的。
激发/释放分辨
微阵列上各点的荧光释放强度通常要比激发光强度弱几个数量级，要从激发光中检测出微弱的荧光信号，就需要对这两种类型的光进行分离，由于光束中的光波长不相同，可利用光波分离将不同的光分开。许多装有目镜的扫描仪采用的是表面照明方式，激发光束与释放光束从样品到目镜经过同样的路径只是方向相反。这种途径使得从样品上反射和散射的光与荧光束混合在一起，所以需要用光束分离器对混合光进行分离。一种类型的光束过滤器是色彩二向或多向过滤器。它将激发光束反射并把释放光束以一较长的波长传输。这种滤光器对一、二或三种不同的激发/释放光都可进行较好的分离，但若超过四种以上的混合光束则分离有困难。另外一种类型的光线分离器称为几何光线分离器，如图3所示，在扫描系统中，目镜的数值孔径为0.6，像素的大小为10mm，从目镜出来的激发光束比释放光束细，一个小反光镜将激光束反射但是让环形部分的释放光束通过，其分离效果与波长光束分离器相同。从理论上来说，光束分离器可以完全将激发和释放光束分开，但实际上并非如此，通常在探测器前放滤光片过滤释放光束。这些滤光片只允许染料的释放高峰附近很窄的一段波长的光通过，而其他波长的光包括激发光都被阻挡了。这是微阵列扫描仪必需的的第二道光束分离装置。有的扫描仪不用光束分离器而是将激发光束和释放光束放在不同的轴上。该方法能将释放光路径的激发光发射回去，但却难以达到较高的数值孔径，因为目镜离样品很近，通常小于1毫米，所以激发光束能进入目镜的角度范围很小。其他具有区分不同波长光束的装置有棱镜、光栅等，这些装置还可产生一些特殊的作用如连续的光波调谐功能。然而，在微阵列中，由于要求对激发光有高度的敏感性，因而对释放光装置也相应要求有很高的精密度。
图3 在上位照明扫描仪中的光束分离器
检测荧光扫描仪的探测器
将微弱的荧光信号转化为电信号,在微阵列扫描仪中的光线探测器有：光电倍增管、CCD点阵探测器、雪崩光电二极管。各种装置有其优点也有其缺点。不同检测范围的仪器要根据它们各自的特点来选择合适的探测装置。光电倍增管在可见光波范围内是最灵敏的探测器，它属于单点探测器并要求扫描系统对微阵列上的样品进行空间定位，通过改变电压可以很方便地改变光电倍增管的灵敏度。光电倍增管的灵敏度在红外及近红外波长范围内降低得很快，所以它们的用途主要限制在可见光波长范围内。CCD对微弱信号的放大功能不及光电倍增管，因而需要额外的放大系统来将信号放大才能达到光电倍增管的灵敏度范围的上限。其主要的缺点是：CCD探测器的实际数值孔径难以达到06-09的范围,在低亮度背景下,限制微弱信号被检测出来, 另外CCD探测器不能与共聚焦系统相兼容;但是在高亮度背景下, 因为CCD探测器有内置式扫描功能,其优越性就体现出来了。
所有的微阵列扫描仪都有固定和放置微阵列固相基质的装置，我们称之为扫描仪的载样盒。载样盒要有能够容纳下玻片的空间，组成其的材料应能经受的住上千次取放样品的刮擦考验。通常微阵列的固体介质为显微载玻片，还有塑料片，但是塑料片不如玻璃片刚硬，容易变形，不易聚焦准确，所以多数研究者使用的是显微载玻片。扫描检测时通常是在室温下进行，此时玻片上各点样品已经干燥，然而，有些染料如FITC在潮湿的环境下才能释放出强烈的荧光，所以研究者们在待测样品上滴加适量的缓冲液，然后盖上盖玻片进行观察。这就需要载样盒能够容纳载玻片与盖玻片叠加之后的厚度，扫描仪在扫描时聚焦于盖玻片下的那一层平面进行扫描。
以下要介绍共聚焦扫描微阵列的工作原理，顾名思义，共聚焦扫描仪将视野中的两个聚焦点的影象装配为二维图象，工作过程如所示：平行的激光束通过光束分离器后进入目镜，目镜采集到部分球状散射的荧光释放光并使这些光成为平行的光束，此外还采集被反射的激光，这些激光的强度要比荧光强度大3-7倍。采集回来的光束再次通过光束分离器，光束分离器将大部分激光反射回激光源处，并允许大部分荧光束通过光束分离器，一面平面镜将荧光束反射到释放光栅处，光栅选择很窄范围波长的光通过，并将剩余的激光激发光全部反射回去。共聚焦的工作特点体现在探测目镜和开了一个针孔大的孔的光线挡板上，探测目镜将平行光聚集为很小直径的一束光之后，挡板上的小孔只允许聚焦的光线通过并将其余的光遮挡住。图5显示若发光点不在目镜焦点范围内，则光线将被探测目镜聚集于挡光板前，散射之后大部分光线被遮挡了，只有焦点范围内的光线才能有效地进入当光板的小孔被探测器检测到。对焦距范围的严格限制使得灰尘或近表面的小颗粒均不能成像被探测到，因而共聚焦扫描仪获得图象的信噪比要高于非共聚焦扫描装置。但另一方面，对焦距范围的严格限制要求载玻片摆放非常平稳，扫描运动过程中载样盒要保持在同一水平面上，偏差要小于焦距的范围，偏差小于±10mm。这一要求增加了机械加工的精密度，使得加工工艺更加复杂，但这是保证获得最佳图象质量的有效途径之一。
图4共聚焦扫描的工作原理
图5目镜焦点范围之外的光线被遮挡
由于激光共聚焦于载玻片上的一点上,要获得整张玻片上的各点的荧光信息则要对玻片各点进行扫描成像。可通过移动扫描器或移动目镜和载玻片来实现上述功能。扫描器移动后要求目镜能采集到荧光释放光束，这样的目镜很复杂且数值孔径不超过0.3，较为简单的并且采集光效率高的办法是移动目镜或载玻片，但移动的物体大势必影响扫描速度。不过在弱光环境下，图象读取速度取决于探测到的光子的累积量，所以即使扫描速度快而光采集效率低的话图象读取信号也未必快。
微阵列扫描仪灵敏度范围要求：在微阵列样品制备过程中，步骤较多，如PCR反应、杂交反应条件变化多、试剂存储条件不同、不同类型的基因表达等因素的影响，即使适用相同的染料，其亮度也可能相差1000倍，在同一快微阵列上的荧光强度范围可达到4000:1的范围。大部分扫描仪的荧光强度读取范围在4000-16000，若不改变仪器的灵敏度范围，就无法适应各种荧光强度样品的读取。调整仪器灵敏度范围的方法有两种：其一是改变激发光的强度，用激光衰减器可调整改变激发光的强度其可调范围至少为100：1。其二是改变光电倍增管的灵敏度，通过变化输入电压的大小，光电倍增管的灵敏度改变范围至少为100：1。两项调整方式可相互叠加使得仪器的调整范围增加到10000：1，这一范围对普通的扫描仪都足够了。通常人们希望使用的激光强度大而不破坏样品上的荧光分子，我们已经知道，激光强度越大激发的荧光光子越多，信号也越清楚和强烈。但是若样品经过多次扫描后，被破坏的荧光光子将增加，所以要将荧光强度降低以防样品上的荧光淬灭。
控制和自动化系统是由电脑来完成的。扫描仪使用者无须精通扫描仪的光学和电子学部分，已商品化的扫描仪已经经过大量的测试和信息反馈并不断地改进，使其用户界面越来越友好，图形化的操作界面使得初学者只需接受简单的训练或阅读操作手册就能够使用仪器。控制软件具有许多自动设置功能，为使用者节省时间提高工作效率。如：不同的用户扫描不同样品可设置、保存、再现扫描参数；可自动设定2个以上的扫描激光波长并自动保存图像结果；对某一扫描波段自动调整灵敏度、激发光强度、及探测器探测范围等。
扫描仪各部件功能参数主要如下：
激光源的数目和荧光波段 第一代微阵列扫描仪通常是两个或四个荧光波段及两个激光光源，而第二代仪器则含三或四个激光光源并可选择10种荧光波段。
另外，分辨率、灵敏度、扫描速度、扫描视野、扫描图像定位的准确程度等指标也是设计和制造微阵列扫描仪所需考虑的技术指标。微阵列扫描仪之间的比较是一个复杂的过程,不应仅仅对单个性能参数进行比较，通常需要对扫描样品进行综合测试。
ScanArray共聚焦微阵列扫描仪
General Scanning ,Inc.公司已经建立了ScanArray共聚焦微阵列扫描仪的生产线，目前全世界的许多生物技术和遗传基因组分析实验室都在使用该种仪器进行科研工作。
ScanArray的结构组成是：样品载体移动、光源固定、多个激光头的共聚焦扫描仪。数值孔径可达0.75，扫描速度达20线/秒。
ScanArray共聚焦微阵列扫描仪优越性能表现在：操作简单、体积小，数值孔径高、扫描速度快，灵敏度和分辨率高。
目前有两种型号：ScanArrayâ3000和ScanArrayâ5000，它们的性能如下：
|
性能指标 |
ScanArray3000 |
ScanArray5000 |
|
结构 |
样品载体移动、光源固定、多个激光头 |
样品载体移动、光源固定、多个激光头 |
|
数值孔径 |
0.75 |
0.75 |
|
载样介质 |
所有标准的1''´3''显微载玻片 |
所有标准的1''´3''显微载玻片 |
|
视野 |
不小于22mm´60mm |
不小于22mm´60mm |
|
扫描速度 |
6线/秒 |
20线/秒 |
|
分辨率 |
10；50（预扫描） |
5，10，20；30；50（预扫描） |
|
激光束 |
两种（543nm和633nm） |
四种（488nm，514nm，543nm，594nm，612nm，633nm） |
|
释放光波段 |
2 |
10 |
|
输出格式 |
16-bit 1 |
16-bit 1 |
|
体积 |
25"长´10.5"宽´11.5"高 |
30"长´15.5"宽´13.5"高 |
|
重量 |
35 |
60-70(取决于激光头的数目) |
参考文献：
Ormerod，M.G.（ed.）.
In Flow cytometry：
a practical approach，P,
29. IRL Press.
Tomei, L.D.(1988). US Patent 4758727.
Kain, R. C.(1998). US Patent 5719391.
Kain, R.C., Miller, M.F., and Majlof, L. (1996).US Patent 5578818.
